Het Cas9-complex (blauw) ‘omarmt’ het gids-RNA (geel) en doel-DNA (rood) (afb: Bang Wong)

CRISPR-Cas is een bacterieel moleculair complex dat gebruikt wordt om heel nauwkeurig genen uit DNA te knippen, maar onderzoekers van MIT in Cambridge (VS) en uit Japan hebben ontdekt dat daarmee ook de expressie (=activiteit) van genen is te sturen.

CRISPRs zijn al in 1987 ontdekt. Het zijn een soort herhaalsequenties op bacterieel en viraal DNA. Met het knipenzym Cas9 en met een RNA-‘gids’, die het knipenzym naar het beoogde doel op het DNA leidt (het doel-DNA), wordt CRISPR-Cas9 sedert een aantal jaren gebruikt voor het bewerken (knippen en plakken) van het eukaryotische DNA van, onder meer, zoogdieren. “Cas-9 is een soort geleid projectiel waarmee we heel precies doelen op het DNA kunnen veranderen”, zegt onderzoeker Feng Zhang. “Dit onderzoek levert het hele schema van het systeem. Het toont het projectiel, het Cas9-eiwit, de instructies, het gids-RNA, en het doel-DNA. Het toont ook hoe die onderdelen samenwerken.” Voor dit onderzoek zocht Zhang samenwerking met Osamu Nureki van de universiteit van Tokio.
Het gecombineerde onderzoek richtte zich op de structuurdetails van het eiwitcomplex in relatie met hun functionele betekenis. Er bleek een soort arbeidsverdeling te heersen op Cas9. Een deel was verantwoordelijk voor het knippen van het DNA, het andere was betrokken bij het herkennen van het RNA en DNA. Die delen van het eiwit wisselwerken ook met het ‘gids’-RNA, waarbij het enzym zich om het RNA en het doel-DNA drapeert om het beoogde stuk uit DNA te knippen. Hieruit concludeerden de onderzoekers dat er meer uit Cas9 gehaald zou kunnen worden dan het knippen van genen. Zhang: “Tot nu toe was het lastig met verstand het eiwitcomplex te bewerken. Nu hebben we meer mogelijkheden dat effectiever te doen.” Met Cas9 en het gids-RNA, daar zijn nu onderhand hele ‘bibliotheken’ van, zijn specifieke genen stil te leggen, maar soms gaat dat niet goed en worden elders dan bedoeld genen weggeknipt. Met hun bredere beeld van het Cas9-systeem willen de onderzoekers nu dit probleem aanvatten.
Ze wilden echter meer: niet alleen genen uitschakelen, maar ook aanzetten, tot expressie brengen (zoals dat genoemd wordt). Dat is al eerder geprobeerd met speciaal ontworpen eiwitten. Dat werkte niet goed. Het vreet tijd en is nogal duur. Er is ook geprobeerd daarvoor Cas9 te gebruiken door het deel van het enzym dat DNA knipt te inactiveren en Cas9 te verbinden met de zogeheten activeringsdomeinen van eiwitten. Deze domeinen zorgen ervoor dat de celmachinerie in actie komt om RNA af te schrijven van DNA (transcriptie). Daarmee is het niet goed gelukt de transcriptie te activeren. De onderzoekers besloten Cas9 te veranderen op basis van een analyse die ze eerder dit jaar publiceerden. Zhang: “Als je de ruimtelijke structuur kent, denk ik dat je het systeem gericht kunt veranderen.”
Andere onderzoekers hadden al geprobeerd de activeringscentra van de eiwitten aan het eind van Cas9 te koppelen, met beperkt succes. Met de kennis van de structuur kwamen de Japanse en Amerikaanse onderzoekers tot de conclusie dat er twee kleine piekjes van de RNA-gids uit het eiwit-complex steken. Die piekjes zouden een betere plek zijn, omdat de activeringscentra daar meer flexibiliteit hebben om de transcriptiemachinerie te hulp te roepen. Met deze opzet probeerden de onderzoekers het Cas9-complex, gekoppeld aan de activeringscentra, bij een tiental genen die met de ‘oude’ Cas9-activatoren moeilijk aan de gang bleken te krijgen. Elk gen verdubbelde tenminste zijn transcriptie en voor de meeste genen bleek die factor ordes groter. Het werkte dus. Vervolgens maakten ze een bibliotheek van zo’n 70 000 ‘gids’-RNA-sequenties voor de meer dan 20 000 menselijke genen. Gewapend met die bibliotheek en de CRISPR-Cas9-techniek konden de onderzoekers genen identificeren die kankercellen resistent maken voor een bepaald geneesmiddel (in dit geval PLX-4720 waarmee huidkanker wordt bestreden).
De Cas9-techniek lijkt zo van steeds meer markten thuis te zijn. Zhang wil de techniek ook gebruiken om genen te activeren om bepaalde ziektes te bestrijden, waarbij hij denkt aan autisme of de ziekte van Alzheimer. Hij wil er ook voor zorgen dat andere laboratoria met deze techniek kunnen werken via Addgene.

Bron: Science Daily