Tas-eiwit (afb: McGoverninstituut/Max Wilkinson)
TIGR-systemen kunnen worden geherprogrammeerd om elke gewenste DNA-sequentie te bewerken en die hebben daartoe afzonderlijke functionele modules. Naast de modulariteit is TIGR zeer compact vergeleken met andere RNA-gestuurde systemen, zoals CRISPR, wat een groot voordeel is bij het bewerken van het genoom. Vaak wordt dat ‘gereedschap’ in onschadelijk gemaakte virussen afgeleverd en die beperken de ‘actieradius’ van de genoombewerking.
“Dit is een zeer veelzijdig systeem met veel verschillende functionaliteiten,” zegt onderzoeksleider Feng Zhang, hoogleraar neurowetenschappen aan het MIT. De TIGR-geassocieerde (Tas) eiwitten die Zhangs team vond, delen een kenmerkende RNA-bindende component die ze interageert met een RNA-gids die het naar een specifieke plaats op het genoom leidt. Sommige knippen het DNA op die plek, met behulp van een aangrenzend DNA-knippend segment van het eiwit. Die modulariteit zou de ontwikkeling van genoombewerking kunnen vergemakkelijken.
Zhang: “De natuur is behoorlijk ongelooflijk. Die heeft een enorme diversiteit en we hebben die natuurlijke diversiteit onderzocht om nieuwe biologische mechanismen te vinden en ze te gebruiken voor verschillende toepassingen om biologische processen te manipuleren.” Eerder had Zhangs team bacteriële CRISPR-systemen aangepast tot genbewerkingsgereedschap dat de moderne biologie heeft getransformeerd.
In hun speurtocht naar nieuwe programmeerbare systemen keken de onderzoekers eerst naar een structureel kenmerk van het Cas9-eiwit dat zich bindt aan de RNA-gids van het enzym. Dat is een belangrijk kenmerk dat Cas9 zo’n krachtig hulpmiddel voor genoombewerking heeft gemaakt. De onderzoekers doorzochten honderden miljoenen biologische eiwitten met bekende of voorspelde structuren, op zoek naar eiwitten die een vergelijkbaar domein deelden.
Om meer ver verwante eiwitten te vinden, gebruikten ze een herhaalproces. Zo ontdekten ze een eiwit, IS110, waarvan eerder door anderen was aangetoond dat het RNA bindt. Vervolgens richtten ze zich op de structurele kenmerken van IS110 die RNA-binding mogelijk maken en herhaalden ze hun zoektocht.
Op dit punt had de zoektocht zoveel ver verwante eiwitten opgeleverd dat ze kunstmatige intelligentie inschakelden om die lange lijst te begrijpen. “Wanneer je herhaald, diepe delft, kunnen de resulterende treffers zo divers zijn dat ze moeilijk te analyseren zijn met behulp van standaard fylogenetische methoden, die afhankelijk zijn van geconserveerde sequenties”, legt Guilhem Faure uit, een informatisch bioloog in het laboratorium van Zhang.
Ki
Met een groot eiwit-ki-systeem konden de onderzoekers de eiwitten die ze hadden gevonden in groepen plaatsen op basis van hun waarschijnlijke evolutionaire relaties. Eén groep onderscheidde zich van de rest en de leden daarvan zouden bijzonder intrigerend zijn doordat ze werden gecodeerd door genen met regelmatig verdeelde repetitieve sequenties die doen denken aan een essentieel onderdeel van CRISPR-systemen. Dit waren de TIGR-Tas-systemen.
Zhang c.s. ontdekten meer dan 20 000 verschillende Tas-eiwitten, die voornamelijk voorkomen in bacteriënbesmettende virussen (bacteriofagen). Sequenties binnen de herhaalregio van elk gen – de TIGR-sequenties – coderen voor een RNA-gids die wisselwerkt met het RNA-bindende deel van het eiwit. Bij sommige bevindt het RNA-bindende gebied zich naast een DNA-knippend deel van het eiwit. Andere lijken zich te binden aan andere eiwitten, wat suggereert dat ze die eiwitten mogelijk naar DNA-doelen kunnen leiden.
Ze experimenteerden met tientallen Tas-eiwitten en toonden aan dat sommige kunnen worden geprogrammeerd om gerichte sneden te maken in DNA in menselijke cellen. Terwijl ze nadenken over het ontwikkelen van TIGR-Tas-systemen tot programmeerbare genoombewerkers, hopen de onderzoekers ook gebruik te kunnen maken van functies die het bewerkingssystem bijzonder flexibel en nauwkeurig (kunnen) maken.
Breder inzetbaar
CRISPR-systemen kunnen alleen gebruikt worden bij DNA-segmenten die geflankeerd worden door korte motieven die bekend staan als PAM’s (protospacer adjacent motifs). Dat geldt niet voor TIGR Tas-eiwitten, hetgeen ze breder inzetbaar maakt. “Dit betekent in theorie dat elke plek in het genoom bewerkbaar zou moeten zijn”, zegt wetenschappelijk raadgever Rhiannon Macrae.
De experimenten vande onderzoekers laten ook zien dat TIGR-systemen hebben wat Faure een ‘dubbelgidssysteem’ noemt, dat wisselwerkt met beide strengen van de dubbele DNA-helix om zich te richten op hun doelsequenties, wat ervoor zou moeten zorgen dat ze alleen werken waar ze door hun RNA-gids worden heengestuurd. Tas-eiwitten zijn compact – gemiddeld een kwart van de grootte van Cas9 – waardoor ze gemakkelijker af te leveren zijn, wat een groot obstakel voor therapeutische inzet van genoombewerking.
Zhangs team is enthousiast over hun ontdekking en onderzoekt nu de natuurlijke rol van TIGR-systemen in virussen en hoe ze kunnen worden aangepast voor onderzoek of therapie. Ze hebben de moleculaire structuur bepaald van een van de Tas-eiwitten waarvan ze vonden dat ze in menselijke cellen werkten, en zullen die informatie gebruiken om hun inspanningen te sturen om het efficiënter te maken. Daarnaast merken ze verbanden op tussen TIGR-Tas-systemen en bepaalde RNA-verwerkende eiwitten in menselijke cellen. Zhang: “Er is nog heel wat te bestuderen en dat kan ons helpen beter te begrijpen hoe deze systemen in mensen worden gebruikt.”
Bron: phys.org