De CRISPR-methode is in een paar jaar tijd razend populair geworden onder genetici en over de hele wereld zijn onderzoekers aan de slag gegaan met die bacteriële afweer om ‘foute’ stukjes in DNA te repareren en om het genoom te bewerken voor onderzoeksdoeleinden. Vervelend is alleen dat de methode niet zo nauw kijkt en nog wel eens een ander stukje DNA ‘meeneemt’ (ook al wordt dat door sommigen weer tegengesproken of tenminste gerelativeerd). Er zijn methoden om die onbedoelde genoombewerking een halt toe te roepen, maar voorlopig zou de enig echte en veilige ‘noodstop’ voor CRISPR er nog niet te zijn. Nature geeft een overzicht. Binnenkort in dit theater?
Het CRISPR-systeem is een verweer van bacteriën tegen bacterievirussen (bacteriofagen oftewel bacterie-eters). Die fagen hebben daar weer een ander wapen tegen verzonnen: anti-CRISPR-eiwitten. Ondertussen zijn er zo’n vijftig van die eiwitten gekarakteriseerd.
Die worden inmiddels ook door onderzoekers ingezet. Sommigen gebruiken die als een soort afstelknop voor de CRISPR-activiteit. Anderen bekijken of die anti-CRISPR-eiwitten iets kunnen betekenen in de strijd tegen biowapens of om insectenbestrijdende technieken als gendruk (om ziekteoverbrengende muggen uit te roeien) te stoppen als die uit de hand loopt. Voorlopig is het ei van Columbus (of een ei) nog niet gevonden. Jennifer Doudna, de ‘ontdekker’ van de potentie van de CRISPR-methode stelt dat elke onderzoeker in dit veld zich de vraag stelt: Hoe gebruik je die methode op een goede manier? “In die richting zal het gaan, maar we zijn daar nog niet.” Inmiddels verschijnt er elke week wel een (wetenschappelijk) artikel over dit onderwerp.
Een deel van het probleem is dat de anti-CRISPR-eiwitten effectief zijn in een bepaald soort CRISPR-bewerking, aangeduid met type I. Het ook hier vaak vermelde CRISPR/Cas9-systeem is een type II-bewerking. Dat is op het ogenblik het favoriete genoombewerkingssysteem en als die anti-CRISPR-eiwitten iets willen betekenen zullen ze dat daar moeten bewijzen.

AcrIIA4

Onderzoekers aan technische hogeschool van Harbin (China) zochten uit hoe een van die ‘anti’s’, AcrIIA4, Cas9 lamlegde. Een paar maanden later toonden Doudna en enkele collega’s aan dat die anti-CRISPR-eiwitten inderdaad praktische waarde hadden: ACrIIA4 samen met of na Cas9 toegevoegd stopte de bewerking. Dat zou volgens Doudna de onbedoelde veranderingen aan het DNA ten minste beperken

Die ‘anti’s ‘ zouden ook de activiteit van CRISPR kunnen beperken tot bepaalde celtypen en weefsels. Het vorig jaar toonden onderzoekers in Japan, Duitsland en de VS onafhankelijk van elkaar aan dat die eiwitten in combinatie met micro-RNA-moleculen (kleine regelaars) de CRISPR-bewerking zich beperken tot bepaalde weefsels. De Amerikanen, aangevoerd oor Erik Sontheimer van de universiteit van Massachusetts, voerden die experimenten ook uit in levende dieren (muisjes, natuurlijk weer). Voor zover bekend het enige experiment met anti’s in levende dieren (en niet alleen in celkweken).
Sontheimer c.s. wilden die anti’s gebruiken om alleen de levercellen te bewerken. Die anti-CRISPR-eiwitten waren overal in het lijfje van de muisjes behalve waar zich micro-RNA 112 bevond en dat is nu precies in de lever. Overal elders werd de CRISPR/Cas9-machine ‘onklaar’ gemaakt. Dat kun je in principe voor alle weefsels doen (mutatis mutandis).

Afweer spelbreker

Het afweersysteem van de patiënt zou echter roet in het eten kunnen gooien. Cas9 schijnt al door het afweersysteem van veel mensen te worden herkend als antigeen/ziekteverwekker en te worden opgeruimd. Ook bij muisjes kan dat gebeuren. Die anti-eiwitten hebben hetzelfde probleem. Ze zouden voor ontstekingsreacties kunnen zorgen in patiënten en dat wil je natuurlijk niet.

Andere CRISPR-remmers

Er zijn echter ook andere CRISPR-remmers. In mei vorig jaar beschreven Amit Choudkary van het Broad-instituut van het MIT in Cambridge (VS) en medeonderzoekers een nieuwe manier om verbindingen op te sporen die de Cas9-machine kunnen afstoppen. De stoffen die de onderzoekers vonden zijn niet zo effectief als de natuurlijke anti-CRISPR-eiwitten, maar hebben wellicht het voordeel dat ze niet worden opgemerkt door het afweersysteem.
Elders ontwikkelden wetenschappers korte stukken DNA en RNA om twee delen van het Cas9-complex aan te pakken om zo de activiteit van die genschaar te stoppen. “We zijn er vrij zeker van dat dit beter werkt dan de anti-CRISPR-eiwitten”, zegt Keith Gagnon. Weer anderen hebben kleine eiwitten gesynthetiseerd die die anti-CRISPR-eigenschappen lijken te hebben.

Noodknop

De anti’s zouden ook kunnen fungeren als een soort ‘noodknop’ bij bio-aanvallen. Voorlopig zijn die zaken nog erg hypothetisch. Anti’s zijn als noodstop alleen nog maar gebruikt bij een gendrukproef met gist, alleen om te kijken of het werkt, maar het zal niet het laatste experiment zijn. Zo denken wetenschappers er aan malaria te voorkomen met behulp van gendruk. Andrea Cristanti van het Imperial College in Londen zegt anti-CRISPR-genen te hebben gebruikt om een gendrukproef te stoppen die ziekteoverbrengende muggen moest uitroeien.
De gendruk, waarbij (in dit geval) de genen van de vrouwtjesmuggen zo zijn veranderd dat ze de voortplanting verstoren, zou een muggenpopulatie in tien generaties kunnen uitroeien (in het lab, tenminste). Toevoeging van antigendrukmuggen zou het uitroeiingsproces 100% kunnen stoppen, stelt de onderzoeker. De resultaten van dat onderzoek zijn nog niet gepubliceerd. Crisanti ziet die benadering als een soort zekering, waarmee je een proces kan stoppen dat fout dreigt te lopen.

Daarnaast zijn die anti’s natuurlijk ook goed te gebruiken in (fundamenteel) onderzoek. Zo kun je de CRISPR-methode gebruiken om genen aan en uit te zetten. Met behulp anti-CRISPR-eiwitten kun je dan achterhalen hoe lang het effect daarvan duurt. Je kunt de anti-CRISPR-eiwitten gebruiken om bij fagen andere verdedigingsmechanismes te ontdekken of ze gebruiken in sensoren enzovoort, enzovoort.

Andere functies CRISPR

Je zou kunnen zeggen dat CRISPR-systeem onschadelijk wordt (kan worden) gemaakt door die anti’s. Waarvoor dient het dan nog? Er zijn onderzoeken die aannemelijk maken dat het CRISPR/Cas-systeem ook een functie heeft in het vormen van slijmlagen, het repareren van DNA en het sturen van processen in bacteriecellen. Het is mogelijk dat het CRISPR-systeem door de virale verdediging met anti’s andere functies heeft gekregen.
Doudna: “We moeten die genoombewerkers goed in de greep krijgen om er zeker van te zijn dat je verandert wat je wil veranderen en niets anders.” Er wordt aan gewerkt, lijkt me.

Bron: Nature