Het enzym Cas9 (Cas staat voor CRISPR-geassocieerd) vormt een sequentiespecifieke endonuclease (=DNA-schaar) als het zich met twee RNA-moleculen verbindt: de RNA-gids (crRNA in de afbeelding) en tracerRNA. 
(afb: pnabio.com)

Toen het menselijk-genoom-project was afgerond, ontstond enige euforie. Nu weten we hoe de boel in elkaar steekt! Tja. Nu zo’n 10 jaar later zijn we nog steeds aan het uitvogelen wat die rond 20 000 genen doen en coderende genen maken maar 2% van het genoom uit. Wetenschap is taaie arbeid. Aan het MIT in het Amerikaanse Cambridge zijn ze enige tijd bezig met een systeem, CRiSPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) geheten, dat moet helpen de raadselen der genen aanzienlijk sneller op te lossen dan met de nu gebruikelijke RNA-interferentiemethode. “Hiermee kunnen we systematisch de genen van zoogdiercellen screenen. Dat helpt om te begrijpen wat de functie is van eiwitcoderende genen, maar ook voor niet-coderende delen van het genoom”, zegt David Sabatini, hoogleraar biologie aan het MIT. 

Met CRISPR is het mogelijk die functie te onderzoeken door in elke cel een bepaald gen te vernietigen en dan te kijken wat er gebeurt. Dat klinkt primitief, maar dat is toch lastiger dan dat op het eerste gezicht lijkt.  Op die manier kwamen de onderzoekers er achter hoe huidkankercellen zich ontwikkelen of welke genen zich ‘verzetten’ tegen chemotherapie. CRISPR is ontwikkeld door Feng Zhang. Hij maakte gebruik van een bacterieel eiwit dat stukjes viraal DNA herkent en verknipt. Dit eiwit, Cas9, wordt door korte stukjes RNA die aan het DNA binden, ‘gidsen’ of crRNA in de afbeelding, gebruikt als dubbele schaar (een voor elke DNA-streng). Door de stukjes RNA de juiste ‘gespiegelde’ volgorde te geven, is heel nauwkeurig een bepaald stukje DNA (bijvoorbeeld een gen) te verwijderen.
Zhang en zijn medewerkers maakten 65 000 RNA-‘gidsen’ voor bijna elk gen. Elke cel kreeg een ‘gids’, waarna het bijbehorende gen werd vernietigd. Als dat gen noodzakelijk was voor de overleving, stierf die cel af. “Voor het eerst hebben we zo op een systematische manier mutaties aangebracht, waarmee we de functies kunnen bepalen”, zegt mede-onderzoeker Ophir Shalem. Op deze manier bepaalden ze de essentiële genen (essentieel voor overleving) van twee typen cellen: kankercellen en pluripotente stamcellen. Ze bepaalden zo ook de genen die melanoomcellen doen overleven en de genen die zich ‘verzetten’ tegen chemotherapie.

In een nevenonderzoek aan het MIT werden ‘slechts’ 7000 genen ‘aangesproken’. De onderzoekers maakten echter voor elk gen meer RNA-gidsen. Ze verwachtten dat elke gids het bijbehorende gen zou blokkeren, maar dat bleek niet zo. “Dat geeft voeding aan de gedachte dat verschillen in RNA-sequenties leiden tot verschillen in de doelmatigheid van het wegknippen van de genen”, zegt student-onderzoeker Tim Wang.
Uit de proefnemingen destilleerden de onderzoekers regels over de doelmatigheid van het CRISPR/Cas9-systeem. Op basis daarvan berekenden ze de sequenties die het succesvolst zijn bij het wegknippen van een bepaald gen. Volgens de onderzoekers geeft dat de grote mogelijkheden van CRISPR aan voor het ontrafelen van de geheimen van het genoom, waarbij de mogelijkheden waarschijnlijk nog veel groter zijn dan nu is te voorzien.

Volgens hen is de CRISPR-benadering effectiever dan de RNA-interferentiemethode (RNAi), op het ogenblik het meest gebruikt om functies van genen te bepalen. Het nadeel van die methode is dat die zich richt op boodschapper-RNA en niet op het DNA zelf. Daardoor is het onmogelijk een gen voor 100% uit te schakelen.
Volgens Michael Elowitz van het Caltech, die niet betrokken is geweest bij het onderzoek, is wat er bij MIT bereikt is enorm belangrijk. “Het betekent een revolutie voor de biologie om dat soort dingen te kunnen doen op die grote schaal, met die nauwkeurigheid. We kunnen nu voor het eerst echt dingen doen om enig inzicht te krijgen hoe dat hele complexe genetische systeem werkt”, zegt hij.
In de toekomst willen de MIT-medewerkers onderzoeken hoe cellen tumoronderdrukkende genen als BRCA1 ‘kwijtraken’. Inzicht op genniveau geeft aanknopingspunten om kanker heel specifiek te bestrijden, stelt Wang. Daarnaast willen ze CRISPR/Cas9 ook inzetten om er achter te komen waarvoor al dat niet coderende DNA voor dient. Slechts 2% van het DNA codeert voor eiwitten. Dat betekent dat van 98% eigenlijk helemaal niks bekend is. Dat wordt nog een hele klus.

Bron: Science Daily