Gang Bao (r) met medewerkers (afb: Rice)

De CRISPR-methode om het genoom te bewerken werd alom toegejuicht als een efficiënte manier om DNA en zelfs RNA te bewerken, maar daar zaten nog wel wat haken en ogen aan. Soms wordt het genoom ook bewerkt op plaatsen waar dat niet de bedoeling was, maar ook als de knip/vervang naar behoren geschiedt, zo lijkt het althans, kan er toch iets misgaan. Die tot nu toe ongeziene missers moeten ook in beeld gebracht worden wil de CRISPR-methode als echt veilig en doeltreffend kan/mag worden ingezet.
Gang Boa van de Amerikaanse Rice-universiteit en medeonderzoekers merkten in 2018 in het blad Nature Biotechnology op dat zo’n CRISPR-bewerking kan leiden tot het wegvallen van hele stukken DNA. “Toen zijn we begonnen te kijken of we daarvan een goede schatting van konden maken.”
De onderzoekers hielden zich eigenlijk bezig met de genezing van sikkelcelanemie met behulp van de CRISPR-techiek. De onderzoekers vrezen dat die ontbrekende stukken DNA na de CRISPR-‘reparatie’ ook gevolgen heeft voor stamcellen en dus ook voor de gezondheid van de behandelde, in hun geval, sikkelcelpatiënt. Dat heet van de regen in de drup terechtkomen.

Bao: “We weten niet goed waardoor een paar duizend basen op de knipplaats verdwijnen in stamcellen als die delen en differentiëren, met gevolgen voor de gezondheid. Dat is het eerste probleem. We hebben wat hypotheses. Het tweede gaat om de biologische gevolgen. Grote ontbrekende delen kunnen ook effect hebben op buurgenen en kunnen ook de expressie (activiteit; as) van die genen beïnvloeden. Wellicht kunnen die resulteren in misvormde eiwitten. Er kan van alles gebeuren. Cellen kunnen sterven of abnormaal worden.”
De onderzoekers hebben een methode ontwikkeld om die lange ontbrekende stukken op te sporen evenals veranderingen in de chromosomen door toevoegingen of verdwijningen van stukken DNA op de knipplaats van de Cas9-genschaar. Daarbij gebruiken ze zogeheten umi’s (unieke moleculaire identificatoren) van achttien basen als een soort streepcode. Bao: “Die voegen we toe aan het DNA dat we willen vermenigvuldigen om de gevolgen van de polymerasekettingreactie (de vermenigvuldiging van DNA; as) zo goed mogelijk te elimineren.” Ook hebben ze dingen verbeterd aan het uitlezen van de DNA-sequenties. Ze hebben hun methode een tikkie fantasieloos LongAmp-seq genoemd.

35,4%

Om hun systeem te testen gebruikten ze Cas9 afkomstig van de bacterie Streptococcus pyogenes om de genen HBB, HBG en BCL11A in bloedstamcellen (belangrijk voor sikkelcelanemie, een bloedziekte) en voorlopercellen van sikkelcelanemiepatiënten te bewerken. Ook bewerkten ze daarmee het PD1-gen in afweercellen.
Ze ontdekten dat er stukken tot enkele duizenden basen (pars pro toto voor nucleotiden) waren verdwenen. Dat gebeurde het meest in bloedstamcellen: 35,4% in het HBB-gen, 14,3% in het HBG-gen en 15,2% in het BCL11A-gen. Bij het PD1-gen in afweercellen gebeurde dat in 15,2% van de gevallen. De onderzoekers gebruikten twee verschillende gids-RNA’s om de genschaar naar de juiste plek op het DNA te brengen. Wat die voor een effect op het resultaat hebben vertelt het persbericht niet (ook het artikel niet, trouwens).

De groep gaat nu ook kijken wat de gevolgen van die verdwenen stukken zijn, vooral voor het aanmaken van het eiwit, maar in eerste instantie van het boodschapper-RNA, een kopie van het gen, dat dient als mal voor het eiwit. Bao: “We willen weten of die veranderingen blijvend zijn in de bewerkte bloedstamcellen na transplantatie.”

Bron: Science Daily