De CRISPR-methode heeft in een relatief korte tijd grote furore gemaakt als manier om het genoom te bewerken, maar er kleven wel wat problemen aan zoals ongewenste mutaties in het DNA en ook een bescheiden ‘actieradius’. Onderzoekers van, onder meer, Harvard hebben nu een nieuwe techniek ontwikkeld waarbij zogeheten retrons (zie voor uitleg verderop onder ‘Retrons’) worden ingezet om tegelijkertijd miljoenen veranderingen in het genoom aan te brengen en waarmee een groot aantal cellen is te verifiëren. Die techniek, retronbibliotheekrecombinatie genoemd (in Engels afko RLR), zou kunnen worden gebruikt als de CRISPR-methode niet (goed) werkt en de bewerkingsresultaten beter zouden moeten zijn, stellen de onderzoekers.
Bij de CRISPR-methode wordt het DNA op een bepaalde plaats doorgeknipt en moet de cel zelf de boel repareren. Dat kan problematisch zijn. Er zijn methodes die een stukje DNA aanbieden om te worden ingebouwd (of ter vervanging wordt ingevoegd) tijdens de replicatie (het ‘verdubbelen’ van een DNA-streng bij celdeling). Daar hoeft geen DNA voor geknipt te worden. Dat is die recombinatietechniek.
Die techniek is eenvoudig en kan in vele cellen worden toegepast om complexe mutatiepatronen te bewerkstelligen waar onderzoekers hun hart aan kunnen ophalen. Om uit te vissen wat de effecten van die mutaties zijn moet elke mutante cel echter geïsoleerd, het genoom uitgelezen en ingedeeld worden. Dat is niet heel erg praktisch.

Onderzoekers van, onder meer, het Wyss-instituut van Harvard hebben nu RLR bedacht die het leven van genoomonderzoekers een stuk makkelijker zou maken. Met RLR kunnen miljoenen mutaties tegelijkertijd worden verkregen, waarbij de cellen een ‘streepcode’ krijgen, zodat de hele gemuteerde ‘boel’ in een keer kan worden uitgelezen en geanalyseerd.
“RLR maakt het mogelijk iets te doen dat met de CRISPR-methode onmogelijk is”, zegt Max Schubert. “We hakken een bacteriegenoom in willekeurige stukken, maken van die segmenten een enkelstrengig DNA en gebruiken dat om miljoenen DNA-sequenties tegelijk te onderzoeken. RLR is een eenvoudiger en flexibere genoombewerkingsmethode (dan CRISPR; as) die kan worden gebruikt voor complexe proeven. Daarmee elimineer je de toxiciteit die vaak kleeft aan CRISPR en verbeter je de mogelijkheden om mutaties op genoomniveau te onderzoeken.”

Retrons

Retrons zijn stukjes in het DNA van bacteriën. Die ondergaan een omgekeerde transcriptie, dat wil zeggen dat er geen RNA ontstaat bij het kopieren van de retrons (zoals bij genen) maar DNA (enkelstrenging). Het was al tientallen jaren bekend dat die retrons bestaan, maar waar dat enkelstrengige DNA goed voor was werd pas in 2020 ontdekt. Met dat retron-DNA kan worden gecontroleerd of de cel is aangevallen door een virus. De retrons vormen dus onderdeel van het afweersysteem van een bacterie.
Aanvankelijk werden retrons als eigenaardigheid van bacteriën gezien, maar de laatste jaren kregen steeds meer onderzoekers belangstelling voor die eigenaardigheid, aangezien die, net als het ook van bacteriën geleende CRISPR, iets konden betekenen voor de bewerking van het genoom. Schubert: “Ook CRISPR werd lang gezien als eigenaardigheid van bacteriën en was men bezig uit te zoeken hoe dat systeem werkte. Nu heeft die methode de wereld veranderd. Retrons vormen ook een bacteriële innovatie die wel eens grote voordelen zou kunnen opleveren.” Zijn aandacht voor retrons werd een paar jaar geleden getrokken doordat die enkelstrengig DNA in bacteriën aanmaakten en dat is een aantrekkelijk proces voor het recombineren van oligonucleotiden (=invoegen van stukken DNA)

Bij deze techiek moet dat stuk enkelstrengig DNA de (gewenste) mutatie bevatten, dat in het DNA van een organisme moet worden ingevoegd. Dat kan op twee manieren. Dubbelstrengig DNA kan worden doorgeknipt met, bijvoorbeeld, de CRISPR-methode, waarna het stukje DNA wordt ingevoegd via het DNA-reparatieproces. Af de ‘mutant’ kan met een bepaald eiwit (ssAP) in een cel worden ingebracht die zich deelt en het DNA gerepliceerd wordt. Daarbij wordt dat stukje ingebouwd in het DNA van de dochtercellen.
“We bedachten dat retrons ons de mogelijkheid gaven om enkelstrengig DNA in cellen te maken die we willen veranderen in plaats dat van buitenaf op te dringen”, zegt medeonderzoeker Daniel Goodman. “En dat zonder het DNA te beschadigen. Dat zijn allebei aansprekende eigenschappen.” Retrons kunnen zelf ook dienen als streepcode waarmee je cellen kunt merken. Dat maakt een preciezer genetisch onderzoek van veel verschillende cellen tegelijk een stuk makkelijker.

Om te kijken of het allemaal zo werkt als gehoopt/aangenomen ‘fabriceerden’ de onderzoekers eerste plasmiden (bacterieel DNA) met antibiotische-resistentiegenen in de retronsequenties plus een gen voor dat speciale eiwit (ssAP) om ervoor te zorgen dat die retronsequenties in het bacteriële DNA zouden worden opgenomen.
Die plasmides brachten ze E. coli-cellen om ervoor te zorgen dat die na 20 generaties in het bacteriële terecht zouden komen. Dat leek maar bij 0,1% het geval te zijn. Ze draaiden vervolgens aan wat ‘knoppen’, zoals het DNA-reparatiesysteem en het deactiveren van genen die coderen voor eiwitten die enkelstrengig DNA afbreken. Dat had succes. De score kwam nu op 90%.
Vervolgens bekeken ze of ze de retrontechniek als ‘uitlezer’ konden gebruiken, waardoor het mogelijk wordt proeven in mengsels uit te voeren. Aangezien elke plasmide een unieke retronsequentie bevat dat fungeert als ‘adres’, bedachten de onderzoekers dat het makkelijker was die korte retrons uit te lezen in plaats van het hele DNA om te bekijken of de mutatie was aangekomen.
De antibioticaresistentiegenen bleken present in de E. coli‘s, meer dan andere mutaties. De methode bleek gevoelig en precies genoeg om de kleine verschillen te meten tussen verschillende, vrij overeenkomstige mutaties. Het uitlezen van de streepcodes maakt het verzamelen van gegevens hiermee een stuk eenvoudiger en praktischer, stellen de onderzoekers, waarbij je geen afzonderlijke bacteriën hoeft te vangen en hun DNA uit te lezen.

Bibliotheek

De onderzoekers waren nog niet tevreden. Ze wilden weten of hun retronmethode ook werkt op willekeurig versnipperd DNA en ze zochten uit hoeveel retrons ze gelijk konden gebruiken. Ze versnipperden het DNA van een E. coli-stam die resistent is voor een ander antibioticum. Ze gebruikten die stukjes om een ‘bibliotheek’ te bouwen van miljoenen DNA-sequenties in de retron-sequenties. Volgens Schubert kwam hier de eenvoud van hun methode duidelijk aan het licht. “We konden een bibliotheek bouwen die duidelijk groter was dan die we gebruiken met CRISPR. In die methode moeten we zowel het gids-RNA als de DNA-sequentie synthetiseren om een mutatie in te voegen.”

“Daarmee kunnen we de effecten van mutaties in het genoom zien. Ook hoe die wisselwerken”, zegt Schuberts baas George Church. “Dit werk helpt ons RLR ook toe te passen in andere genetische systemen (ik neem aan in eukaryote cellen zoals wij die hebben; as).”

De retronmethode zou gecombineerd kunnen worden met de CRISPR-methode om de effectiviteit van genoombewerking te verbeteren, maar zou ook als alternatief kunnen worden gebruikt. Er moet nog wel aan gesleuteld worden, maar de onderzoekers denken dat voor hun retrontechniek een schone toekomst is weggelegd.

Bron: Science Daily