Twee priembewerkingssystemen: PAM en RT (afb: Phillip Sharp et al./Nature)

Er wordt constant volop gesleuteld aan de CRISPR-techniek die onderzoekers van de bacteriën hebben geleend om het genoom te bewerken. Een van de belangrijkste minpunten is dat die techniek nogal eens onbedoelde veranderingen in het DNA veroorzaakt. Onderzoekers van MIT lijken een manier gevonden te hebben om de genoombewerking (weer) veiliger en nauwkeuriger te maken, die dan meteen weer ‘doorbraak’ heet in het MIT-persberivht. Door de CRISPR-genschaar scheikundige wat aan te passen zou een systeem zijn gekregen dat zestig keer minder fouten maakt dan voorheen.
Volgens Phillip Sharp zou het om een nieuwe aanpak gaan voor genbewerking die het afleversysteem (het CRISPR-gereedschap moet in de cel gebracht worden) niet moeilijker maakt en geen extra stappen toevoegt, maar veel nauwkeuriger is en minder ongewenste veranderingen veroorzaakt.
Met behulp van die verfijnde methode verlaagden het MIT-onderzoekers het aantal fouten bij priembewerking van ongeveer één op de zeven bewerkingen naar ongeveer één op de honderd voor het meest voorkomende type bewerking. In een nauwkeurigere bewerkingsmodus ging de verbetering van één op de 122 naar één op de 543.
“Voor elk medicijn wil je iets dat effectief is, maar met zo min mogelijk bijwerkingen”, zegt medehoodauteur Robert Langer van MIT. “Voor elke ziekte waarbij je genoombewerking zou kunnen toepassen, denk ik dat dit uiteindelijk een veiligere en betere manier zou zijn.”

In de jaren negentig was vroege gentherapie gebaseerd op het inbrengen van nieuwe genen in cellen met behulp van gemodificeerde virussen. Later ontwikkelden wetenschappers technieken die enzymen zoals zinkvingernucleasen gebruikten om genen direct te repareren. Deze enzymen werkten, maar waren moeilijk te herstructureren voor nieuwe DNA-doelen, waardoor ze traag en omslachtig in gebruik waren.
De ontdekking van het CRISPR-systeem in bacteriën veranderde alles. CRISPR maakt gebruik van een enzym genaamd Cas9, aangestuurd door een stukje RNA, om DNA op een specifieke locatie te knippen. Onderzoekers hebben het aangepast om foutieve DNA-sequenties te verwijderen of gecorrigeerde DNA-sequenties in te voegen met behulp van een RNA-gebaseerde template, waardoor genbewerking sneller en flexibeler wordt.

Priembewerking

In 2019 introduceerden wetenschappers van het Broadinstituut van MIT en Harvard priembewerking, een nieuwe versie van CRISPR die nog preciezer is en minder snel onbedoelde delen van het genoom beïnvloedt. Recenter werd die techniek met succes gebruikt bij de behandeling van een patiënt met chronische granulomateuze ziekte (CGD), een zeldzame aandoening die witte bloedcellen verzwakt. In principe zou deze technologie uiteindelijk gebruikt kunnen worden om honderden genetische ziekten aan te pakken door kleine mutaties direct in cellen en weefsels te corrigeren, stellen de onderzoekers.
Een van de voordelen van priembewerking is dat er geen dubbelstrengs knip in het doel-DNA hoeft te worden gemaakt. In plaats daarvan wordt een aangepaste versie van Cas9 gebruikt die slechts één van de strengen knipt, waardoor een flap ontstaat waar een nieuwe sequentie kan worden ingevoegd. Een gids-RNA dat samen met de priembewerker wordt geleverd, dient als sjabloon voor de te bewerken locatie.

Een van de redenen waarom priembewerking als veiliger wordt beschouwd, is dat het niet beide DNA-strengen knipt. In plaats daarvan wordt een mildere, enkelstrengs knip gemaakt met behulp van een aangepast Cas9-enzym. Dit opent een klein klepje in het DNA waar een nieuwe, gecorrigeerde sequentie kan worden ingevoegd, geleid door een RNA-sjabloon.
Zodra de gecorrigeerde sequentie is toegevoegd, moet deze de oorspronkelijke DNA-streng vervangen. Als de oude streng zich in plaats daarvan weer hecht, kan het nieuwe fragment soms op de verkeerde plek terechtkomen, wat leidt tot onbedoelde fouten.

De meeste van deze fouten zijn onschadelijk, maar in zeldzame gevallen kunnen ze bijdragen aan tumorgroei of andere gezondheidsproblemen. In huidige systemen voor priembewerking kan het foutpercentage variëren van ongeveer één op de zeven bewerkingen tot één op de 121, afhankelijk van de bewerkingsmethode. “De technologieën die we nu hebben, zijn echt veel beter dan eerdere gentherapiegereedschappen, maar er is altijd een kans op deze onbedoelde gevolgen”, zegt medeonderzoeker Vikash Chauhan.
Vanwege die foutenpercentages besloot het MIT-team gebruik te maken van een fenomeen dat ze in een onderzoek uit 2023 hadden waargenomen. In dat artikel ontdekten ze dat Cas9, hoewel het normaal gesproken elke keer op dezelfde DNA-locatie knipt, sommige gemuteerde versies van het eiwit een versoepeling van die beperkingen vertonen. In plaats van altijd op dezelfde locatie te knippen, knipten die Cas9-eiwitten soms één of twee basen verder in de DNA-sequentie.
Dat, zo ontdekten de onderzoekers, maakt de oude DNA-strengen minder stabiel (???; as), waardoor ze worden afgebroken. Hierdoor kunnen de nieuwe strengen gemakkelijker worden opgenomen zonder fouten te veroorzaken.

Cas9-mutaties

In het nieuwe onderzoek konden de onderzoekers Cas9-mutaties identificeren die het foutenpercentage terugbrachten tot 1/20e van de oorspronkelijke waarde. Door paren van die mutaties te combineren, creëerden ze vervolgens een Cas9-genschaar die het foutenpercentage nog verder verlaagde, tot 1/36e van de oorspronkelijke waarde.

Om de bewerkers nog nauwkeuriger te maken, integreerden de onderzoekers hun nieuwe Cas9-eiwitten in een priembewerkingssysteem met een RNA-bindend eiwit dat de uiteinden van de RNA-sjabloon efficiënter stabiliseert. Deze uiteindelijke genschaar, die de onderzoekers vPE noemen, had een foutpercentage van slechts 1/60e van het origineel, variërend van één op de 101 bewerkingen tot één op de 543 bewerkingen voor verschillende bewerkingsmodi. Deze tests werden uitgevoerd in muizen- en menselijke cellen.

De onderzoekers werken nu aan het verder verbeteren van de efficiëntie van priemberwerkers door verdere aanpassingen aan Cas9 en aan het gids-RNA. Ze hopen ook dat andere laboratoria de nieuwe aanpak in hun onderzoek zullen gaan gebruiken. Priembewerkers worden vaak gebruikt om veel verschillende vragen te onderzoeken, waaronder hoe weefsels zich ontwikkelen, hoe populaties kankercellen evolueren en hoe cellen reageren op medicatie.
“Genoombewerkers worden veel gebruikt in onderzoekslaboratoria”, zegt Chauhan. “Het therapeutische aspect is dus spannend, maar we zijn erg benieuwd hoe mensen onze bewerkers gaan integreren in hun onderzoeksworkflows.”

Bron: Science Daily