Bacterie, model E. coli, met synthetisch DNA (afb: univ. van Cambridge)

Makkelijk zat, zegt iemand die een beetje is ingevoerd. Je plakt de verschillende nucleotiden (ook wel aangeduid met basen, de bouwsteen van het DNA) aan elkaar en gaat daarmee door tot je je bij het eind bent. Tja, zoiets is het wel, maar makkelijk is het niet. Tot voor niet zo heel lang geleden kwamen bedrijven die stukjes DNA synthetiseren voor onderzoeksdoeleinden niet veel verder dan zo’n duizend nucleotiden. Je kunt wel verder gaan, maar dan wordt het aantal fouten in je syngenoom te groot (vooropgesteld dat je een bepaald genoom wil synthetiseren en niet zo maar wat). Vaak werd voor langere stukken de hulp van bacteriën ingeroepen om die korte stukjes aan elkaar te plakken zo zijn ook de eerste bacteriegenomen ‘gesynthetiseerd’ en die zijn vele malen kleiner dan genomen van zoogdieren. Daar hebben we het over miljarden nucleotiden. Inmiddels lijkt de ontwikkeling zo ver gevorderd dat we een stuk verder komen tot chromosomen of zelfs hele genomen. Nog niet in de orde van miljarden basen, maar wel van een miljoen…

Leslie Mitchell wilde na haar promotie aan de universiteit van Ottawa (Can) een baan in de industrie zoeken, maar Jef Boeke, een van haar co-promotoren, nodigde haar uit bij hem aan de Johns Hopkinsuniversiteit te komen werken in Baltimore. Boeke was bezig met een ambitieus project om een gistgenoom helemaal vanaf de eerste nucleotide op te bouwen: het Sc2.0-project. Een aanbod dat ze niet kon afslaan. “Ik dacht alleen dat dit een mooie manier is om biologie te studeren en die echt begrijpen. Iets van de grond af aan opbouwen.”
Acht jaar later werken Boeke en Mitchell bij de universiteit van New York en zijn ze, samen met onderzoeksgroepen in Europa, Azië en Australië dicht in de buurt van hun doelstelling: het bouwen van een, aangepast, genoom, dat wil zeggen alle zestien chromosomen van de gist Saccharomyces cerevisiae (bakkersgist) plus een nieuw, zeventiende.
Tot nu is er maar een handjevol genomen gesynthetiseerd, meestal van bacteriën. Jason Chin en zijn groep in Engeland heeft het genoom van de welbekende darmbacterie Escheria coli nagebouwd en onderzoekers van het J. Craig Venterinstituut in Californië hebben het (minimale) genoom geconstrueerd van Mycoplasma mycoides, maar dan hebben we het over genomen van enkele honderden genen. Gistcellen zijn, net als onder veel meer zoogdiercellen, eukaryoten, cellen met een kern  en een veel ingewikkelder genoom (12.156.677 baseparen en 6275 genen).

Onderwijl is de techniek om dat te kunnen doen (dus) aanzienlijk verbeterd, maar biologische systemen zijn geen simpele elektronische systemen die je even aanpast. Het schijnt nog steeds onmogelijk te zijn om zo’n systeem te ontwerpen dat precies doet wat je wil. “De ingewikkeldheid van genoomontwerp is nog steeds te groot voor de middelen die we hebben”, zegt synbioloog Patrick Cai van de universiteit van Manchester.

Beginjaren

In de beginjaren van de synthetische biologie nauwelijks twintig jaar geleden kampten de onderzoekers met twee grote problemen: ze konden geen grote stukken DNA synthetiseren en konden die ook niet kopen van bedrijven (die overigens ook tegen dat probleem aanliepen. Zo rond die tijd kostte een stukje gesynthetiseerd DNA zo’n 15 euro per nucleotide. Tegenwoordig is het betaalbaar een heel chromosoom te laten synthetiseren, een deel van het DNA, voor ongeveer een kwartje per nucleotide. Cai: “Het kost ongeveer twee ton om 700 kilobasen (700 000; as) te maken.” Bij het Sc0.2-project betaalden ze per nucleotide zelfs de helft.

De grenzen lijken echter bereikt. Er zal iets nieuws verzonnen moeten worden. De techniek die gebruikt wordt, de fosforamidietsynthese is al tientallen jaren oud. Daarmee is een lengte van 200 basen zo’n beetje het maximum.
Syntheses met behulp van enzymen lijken de toekomst te hebben. In 2018 demonstreerden onderzoekers rond Jay Kiesling van de universiteit van Californië in Berkeley een dergelijk proces, alhoewel het resultaat nog niet was om over naar huis te schrijven (tien basen). Vorig jaar meldde het Franse bedrijf DNA Script een resultaat van 200 nucleotiden met een dergelijk proces en dat record staat nog. Ook andere bedrijven houden zich daar mee bezig. De verwachting is dat met een jaar of vijf de enzymatische aanpak de fosforamidietsynthese heeft bijgehaald.

Onderzoekers besteden de aanmaak van DNA-fragmenten van een paar duizend basen nu uit aan dat soort bedrijven. Groter is mogelijk, maar dan loopt de prijs per base op. Mitchell: “Het hangt er een beetje van af wat je op je bankrekening hebt staan en hoeveel tijd je kunt besteden om het DNA samen te stellen.” Junbiao Dai, directeur van het laboratorium voor synthetische genomie in Shenzhen heeft het over lengtes van twee- tot drieduizend nucleotiden. “Ik doe de assemblage in het eigen lab omdat ik de ervaring heb dat we dat veel sneller kunnen doen.”
Er zijn diverse methoden om die stukjes aan elkaar te plakken. Daniel Gibson van het Craig Venterinstituut en collega’s gaan uit van DNA-segmenten met overlappende einden. Met behulp van het enzym endonuclease en andere enzymen worden vervolgens de eindjes aan elkaar geknoopt (zie plaatje genassemblage).
Daarmee kun je DNA-segmenten bouwen tot zo’n 50 000 nucleotiden. Het probleem is dat dat proces moeite heeft met repetitieve stukken en die methode is ook niet zo geschikt voor het aaneenknopen van een heleboel kleine stukjes DNA. “Die is echt slecht in het assembleren van echt lang DNA en heel kort”, zegt synbiologe Nicola Patron van de Earlhaminstituut in Norwich (End), die zich vooral met plantengenomen bezighoudt. Zij zweert bij de methode die Golden Gate-assemblage wordt genoemd.

Golden Gate-assemblage

Er zijn manieren ontwikkeld om (kleinere) stukken DNA te ‘assembleren’. Het echte grote werk doen meestal gistcellen (afb: Nature)

Die assemblagemethode is ontwikkeld door Sylvestre Marillonet van Icon Genetics in het Duitse Halle. Bij die methode worden eiwitten (zogeheten IIS-restrictie-enzymen) gebruikt die het DNA op bepaalde plaatsen doorknippen, begeleidt door gids-RNA. Ook hier ontstaan ‘losse’ eindjes waarvan de lengte instelbaar is. In een enkele stap kunnen dan vijf stukken aan elkaar geknoopt worden tot een lengte van tienduizenden nucleotiden.
Ook hier zit een addertje onder het gras. De herkenningsplaatsen waar het DNA doorgeknipt wordt moeten niet vaker voorkomen, althans niet op een plek waar niet geknipt moet worden.
Er bestaat ondertussen een hele ‘bibliotheek’ van gestandaardiseerde Golden-Gate-sequenties zoals genen, promotoren (het regelgedeelte van een gen) en dergelijke als in een legobouwdoos. Daar is in het Amerikaanse Cambridge zelfs een ‘opslagplaats’ voor die niet op winst uit is: AddGene. De plantengroep van Patron heeft een eigen ‘bibliotheek’ van zo’n 350 ‘onderdelen’.

Zowel de Gibsonmethode als de GoldenGate-aanpak zouden goedkoop zijn. Tom Ellis van het University College in Londen schat dat elke standaardreactie minder dan 5 euro kost. Het zou nieuwe gebruikers weinig moeite kosten de methodes onder de knie te krijgen. “We hebben een student die binnen drie weken met Golden Gate een stuk kon assembleren dat uit meer genen bestaat”, zegt Patron.
Als we echter praten over honderdduizenden of miljoenen bouwstenen dat wordt het andere koek. Nu zijn onderzoekers nog steeds afhankelijk van bestaand leven om dergelijke klussen te klaren. Zo hebben bakkersgistcellen een uitstekend DNA-recombinatiesysteem. Daar kunnen de onderzoekers dan gebruik van maken door een cel te voeden met stukken DNA met ‘losse eindjes’. “Zulke in-vivogistassemblage wordt voor alle synthetischchromosoomprojecten gebruikt, voor zover ik weet”, zegt genetica Nili Ostrov van Harvard.

Het assemblageproces voor grotere DNA-lengtes verloopt (dus) stapsgewijs. De Sc2.0-groep van Dai maakt gebruik van de Golden Gate-methode. Bij dat proces is het zaak het verloop scherp in de gaten te houden om te voorkomen dat je met de brokken komt te zitten. “We vervangen het eigenlijke genoom met drie 10-kbasefragmenten per keer.”
Die, relatief, lange sequenties zijn moeilijk te hanteren. Zo kunnen oplossingen met stukken tot een paar duizend basen nog gepipetteerd worden, maar bij langere sequenties verwoest pipetteren het DNA (in opbouw). Met alle voorzichtigheid die je in acht moet nemen om een goed eindresultaat te krijgen komen de onderzoekers uiteindelijk nog een heel eind. Dat minimale genoom van M. mycoides bevat meer dan eenmiljoen basen. Het langste bakkersgistchromosoom is de helft langer. In China hebben onderzoekers het hele bakkersgistgenoom geperst in een enkel chromosoom van zo’n twaalfmiljoen basen.

Kopiëren met variaties

Tot nu toe kwam het synthetiseren van genomen voor het overgrote deel neer op het kopiëren van het origineel met wat variaties. Zo hebben Ostrov en de haren maar 57 van de 64 mogelijke codons (een drietal nucleotiden achter elkaar die coderen voor een bepaald aminozuur) gebruikt. Het gistgenoom dat Cai c.s. proberen te synthetiseren zal het zonder de genen moeten doen die coderen voor transcriptiefactoren (eiwitten die bij het afschrijven van de DNA-code op boodschapper-RNA actief zijn). “Dat zijn onruststokers. Die tRNA-genen hebben de neiging schade te veroorzaken en de zaak te herrangschikken. We bouwen het neochromosoom, maar dat is nog steeds superinstabiel en je kunt je voorstellen waarom dat is: we gooien alle slechte eieren in een mandje.”

Verder

Terwijl hele trossen onderzoekers zich nog bezighouden met het bouwen van genomen zijn andere onderzoekers al weer verder aan het kijken naar het bouwen van volledige organismes zoals gistcellen of E. coli’s maar ook zoogdiercellen(maar dan net even anders). Zo hebben veel onderzoekers steun bij elkaar gezocht in het GP-Write-consortium. Dai organiseert iets soortgelijks in China. Daar zullen ze aanvankelijk vooral kijken naar de ‘simpele’ organismen zoals bacteriën en virussen, maar allengs zal daar ook de aandacht verschuiven naar ‘hogerop’.

In een onlangs verschenen beleidsnota van GP Write werd de nadruk gelegd op het ontwikkelen van alternatieven voor de rol van gistcellen in het assemblageproces. Genomen die gemaakt zijn in gistcellen laten zich uiterst lastig naar andere celtypen verplaatsen. Voorlopig zijn die alternatieven er nog niet.
Daarnaast is ook de informatische ondersteuning een probleem. Er wordt vaak een vergelijking gemaakt tussen biologische systemen en elektronische, maar die vergelijking is eigenlijk een aanfluiting. “DNA heeft een veel rijkere taal met zijn eiwitten, vele bindingsplaatsen en dergelijke”, zegt elektroingenieur Douglas Densmore van de universiteit van Massachusetts die de ‘overstap’ jaren geleden gemaakt heeft. Volgens hem hebben methodes als Golden Gate wel modulaire aspecten overeenkomstig met de elektronica, maar het relatief gebrek aan standaardonderdelen kan de synthese bemoeilijken. “Er zijn ontwerpmiddelen maar die haperen omdat de bibliotheken niet goed gedefinieerd of niet modulair zijn.” Het blijft ook de vraag of die elementen overdraagbaar zijn van soort op soort.
Veel bestaande, bruikbare programmatuur is er ook niet. De onderzoekers moeten die zelf ontwikkelen. Boeke heeft aangekondigd een opzet te maken voor een samenwerking voor de ontwikkeling daarvan. GP Write vergadert in november in New York om o.m. dit probleem aan te pakken, met een heuse prijs voor de ‘winnaars’.
Een punt is ook dat als onderzoekers vertrekken ze vaak de kennis van een systeem met zich meenemen. Een groeiend aantal instellingen heeft daarom iets opgezet als een faciliteit waar onderzoekers gebruik van kunnen maken. Patron heeft zo’n wat zij noemt ‘biogieterij’, die in 2016 is opgezet. Wereldwijd zijn daar er zo’n twintig van. Cai denkt dat onderzoekers ook meer onderling zullen gaan uitbesteden: hier ontwerpen en je DNA-ontwerp bij zo’n gieterij laten synthetiseren. Cai heeft in 2016 zoiets opgezet bij de universiteit van Edinburgh. Wordt ongetwijfeld vervolgd.

Bron: Nature