Inactieve Cas9 (blauw) wordt door gids-RNA naar de juiste plek op DNA geleidt, waar Fok1-nucleases (geel) het knipwerk doen (afb: Joung)

Onderzoekers van het algemeen ziekenhuis in Massachusetts, onderdeel van de Harvard-universiteit, hebben het zogeheten CRISPR/Cas-systeem om genveranderingen aan te brengen zodanig aangepast dat het risico op misproducties aanzienlijk kleiner is geworden, zo valt te lezen in Nature Biotechnology. Ze gebruikten daarvoor twee gids-RNA’s.”Dit systeem combineert het gemak van het breed toegepaste CRISPR/Cas-systeem met een dimerisatie-afhankelijke nuclease-activiteit, hetgeen leidt tot een grotere graad van nauwkeurigheid”, zegt onderzoeker Keith Joung, “Een hoger nauwkeurigheid is essentieel voor de klinische toepassing in de toekomst van deze nucleases en de nieuwe eiwitten die wij beschrijven zouden van grote betekenis kunnen zijn voor het therapeutisch redigeren van het genoom.”

Synthetische CRISPR/Cas-nucleases – een systeem om het genoom te ‘redigeren’ met stukjes RNA passend op het beoogde stukje DNA en het DNA-knipenzym Cas9 – zijn pas in 2012 tot ons gekomen. De methode is eenvoudiger in gebruik dan de oudere redigeringstechnieken als zinkvingernucleases en het TALEN-systeem. In juni 2013 schreef Joungs groep in een eerder artikel dat het CRISPR/Cas-systeem ongewenste mutaties in menselijke cellen zou kunnen veroorzaken, zelfs op plaatsen die verschilden van de bedoelde DNA-locaties (zelfs tot een verschil van vijf nucleotiden, de bouwstenen van DNA).
Om dat probleem aan te pakken ontwikkelden de onderzoekers een nieuw systeem, waarbij de beoogde functie van het knipenzym Cas9 werd gekoppeld aan een nuclease die was afgeleid van het enzym Fok1, dat alleen werkt als twee exemplaren van het molecuul aanwezig zijn (gepaard, vandaar de term dimerisering). Daarmee verdubbelt het stuk DNA dat kan worden herkend voor het knipwerk, waardoor de nauwkeurigheid van het knutselen aan het genoom in menselijke cellen (en zeer waarschijnlijk ook andere cellen) aanzienlijk toeneemt. De nieuwe RNA-begeleide Fok1-nucleases zijn even doelmatig als de bestaande Cas9-nucleases bij kortere stukjes DNA.

“Die verdubbeling van te herkennen DNA betekent een uitbreiding van de genoomredigeringsmiddelen bij een aanzienlijke hogere betrouwbaarheid in vergelijking met de bestaande CRISPR/Cas-nucleases en nickases (knipt een losse DNA-streng)”, zegt Joung. De onderzoekers hebben ook programmatuur ontwikkeld waarmee doellocaties op het DNA zijn op te sporen met deze gids-RNA-nucleases, die ze integreerden in het vrij verkrijgbare programma ZiFit Targeter, een hulpmiddel bij het knutselen aan DNA.,

Bron: Eurekalert