De aanzet tot een DNA-printer (afb: UCB)

Het synthetiseren van stukjes DNA schijnt nog steeds lastig te zijn. Al gauw ontstaan er in het lab bij het aan elkaar plakken van de basen/nucleotiden fouten en veel verder dan een paar honderd basen aan elkaar komen we nog niet (vergelijk dat met de honderden miljoenen nucleotiden die een zoogdiergenoom bevat). Nu schijnen onderzoekers van de universiteit van Californië in Berkeley en van het Amerikaanse Lawrence Berkely-lab een methode gevonden te hebben om sneller en trefzekerder nucleotiden aan elkaar te plakken tot strengen die wel tien keer langer zijn en waarbij bovendien geen giftige chemicaliën worden gebruikt. De onderzoekers beginnen al te denken in termen van DNA-printers.
“Als je een werktuigbouwkundige bent dan is het heel handig als je een 3d-printer hebt om ’s nachts iets te printen dat je de volgende dag kunt testen”, zegt promovendus Dan Arlow. “Een onderzoeker of bioingenieur die een apparaat heeft waarmee DNA geproduceerd kan worden, een DNA-printer, kan ideeën sneller toetsen. Dat is goed voor de innovatie.”

Arlow en zijn Duitse collega Sebastian Palluk van de TU Darmstadt hebben hun ideeën dienaangaande beschreven in Nature Biotechnology. “Ik denk dat de methode van Dan en Sebastian een revolutie in de DNA-synthese kan worden”, stelt de bekende synbioloog Jay Keasling.
Palluk kwam naar Berkeley om met Arlow in het lab van Keasling aan de problemen met de synthese van DNA te werken. Daar wordt veel geëxperimenteerd met het toevoegen van genen aan micro-organismen om die op een duurzame manier voor de mens nuttige producten te laten aanmaken zoals medicijnen, biobrandstoffen en andere chemicaliën.
Het synthetiseren van DNA schijnt een bloeiende bedrijfstak te zijn geworden. Onderzoekers bestellen daar hun DNA-sequenties om die uit te proberen, maar die sequenties maken is nog steeds een lastig karwei. Tien jaar geleden was ik in Duitsland bij een bedrijf (Geneart in Regensburg) dat dat deed. Destijds hadden ze het over een maximaal haalbare lengte van een paar honderd nucleotiden en veel verder zijn die bedrijven kennelijk nog niet gekomen.

Er zijn al onderzoekers die werken aan DNA als opslagmedium aangezien de opslagcapaciteit daarvan enorm is. Een gram DNA kan, in theorie, net zo veel informatie opslaan als 50 miljoen dvd’s en DNA blijft honderden jaren stabiel. Dat is mooi maar zo’n streng moet je natuurlijk wel snel en foutloos kunnen produceren, anders schiet het niet op.

40 jaar oud

De huidige synthesetechniek is zo’n veertig jaar oud. De maximaal haalbare lengte is niet het probleem, maar het voorkomen van fouten. Als een streng langer is dan 200 basen wordt het aantal fouten al gauw te groot. Om zelfs een klein gen van zo’n 1500 basen te maken moeten de DNA-bouwers steeds stukjes van zo’n 200 basen aan elkaar ‘lassen’. Dat kost veel tijd en gaat nogal eens fout. Zo’n klein gen kost al gauw twee weken productie en zo’n 250 euro. En dan te bedenken dat onderzoekers als Arlow, Palluk en Keasling bij hun experimenten vaak een dozijn genen toevoegen aan het DNA van micro-organismen, dan kun je indenken welke problemen de stroeve productie met zich meebrengt voor de onderzoekers.

iGEM

.
Palluk: “Als student in Duitsland nam ik deel aan een internationale synbiologiecompetitie, iGEM. Daar probeerden we E. coli-bacteriën zo te veranderen dat ze kunststoffen zouden afbreken, maar ik besefte al snel dat de meeste tijd ging zitten in het maken van het DNA, zodat we niet niet konden uitvinden of de bacteriën ook daadwerkelijk kunststof afbraken. Dat heeft me aangezet om me bezig te houden met de DNA-synthese.”
Bij de synthese wordt een geactiveerde bouwsteen van DNA gebruikt die giftig is en er moet er regelmatig gespoeld worden met organische oplosmiddelen. Het lastige proces en het feit dat het proces ontzettend vochtgevoelig is heeft onderzoekers ontmoedigd om zelf hun DNA te ‘bereiden’ in eigen lab.

Afweersysteem

De nieuwe methode maakt gebruik van een (ook menselijk) enzym dat in afweercellen wordt gevonden en meehelpt bij het toevoegen van nucleotiden aan DNA in een waterige omgeving, waar dat kernzuur het stabielst is. De techniek zou DNA-strengen aan kunnen die zo’n tien keer groter zijn dan de huidige 200 basen. Dan praat je over een middelgroot gen.
Palluk: “We komen met een methode uit de natuur zelf. Dat is veelbelovend omdat die enzymen zich na miljoenen jaren ontwikkeling hebben bewezen in precieze chemie.”

Cellen maken DNA normaal gesproken niet vanaf de eerste base. Ze kopiëren vaak andere sequenties, waarbij allerlei polymerases hun rol spelen. Een van die polymerases, werd in de jaren 60 ontdekt, is niet afhankelijk van ‘voorbeeld-DNA’, maar voegt willekeurig nucleotiden toe aan genen die antilichamen maken: terminaal deoxynucelotidyltransferase gedoopt (TdT). Dat enzym varieert het oorspronkelijk gen door willekeurig toevoeging van basen, waardoor antilichaameiwitten nieuwe indringers beter te lijf kunnen gaan.
TdT voegt alle vier de basen even makkelijk toe, is snel (200 basen per minuut als je het enzym zijn gang laat gaan). Het is al vaker geprobeerd dat enzym ‘in te lijven’ voor de DNA-synthese, maar het laat zich lastig sturen. De moeilijkheid was uit te vinden hoe je het enzym een nucleotide kunt laten toevoegen en dan stoppen om zo de verlangde sequentie te kunnen maken.
Er is geprobeerd dat te bewerkstelligen door nucleotiden te gebruiken met een soort blokkeringsgroep, die zorgt dat de toevoeging stopt. Om de streng langer te maken werd dan telkens die blokkerende groep verwijdert.
Palluk: “Die benaderingen hebben veel gemeen met de nieuwe sequentietechnologie.” Daar kan TdT niks mee. De reactieplaats op het enzym is te krap om ook nog een blokgroep te kunnen omvatten als de nucleotide in de juiste positie verkeert.
Arlows idee was om een nucleotide aan het enzym vast te maken. Dat blijft vastzitten en kan niet de volgende bouwsteen toevoegen. Na de toevoeging wordt de ‘lijn’ doorgeknipt en is het enzym weer in staat de volgende steen te ‘metselen’.

Het bleek dat die simpele techniek in de eerste experimenten snel en accuraat was, bijna zo nauwkeurig als de bestaande technieken. Arlow: “Ongeveer 80% had de gewenste volgorde van tien nucleotiden. Dat betekent dat elke stap ongeveer 98% goed is en dat is niet slecht. We willen, 99,9% halen om lange sequenties te kunnen maken.”
Dan praten over de mogelijkheid 1000 basen samen te voegen met een opbrengst van 35%. Met de huidige techniek is dat volgens Palluk onmogelijk te doen. “Het is onze droom in een keer een gen te produceren en dat in een paar dagen bij de onderzoekers te hebben.”

Bron: EurekAlert