Cas9 is nogal ‘omvangrijk’ (afb: WkiMedia Commons)
CRISPR-Cas wordt wereldwijd gebruikt om genen in organismen te bewerken, in te voegen, te verwijderen of te reguleren. TnpB, een veel kleinere voorloper van de bekende ‘genschaar’ Cas-eiwitten, is gemakkelijker cellen te krijgen. Onderzoekers van, onder meer, de universiteit van Zürich hebben dat minder effectieve alternatief voor Cas-eiwitten nu verbeterd (met de onontkoombare ki) verbetert om een reëel alternatief te worden van die veel gebruikte maar erg ‘gewichtige’ Cas-eiwitten. Overigens lijkt de Chinese onderzoeker Guanghai Xiang daarin geslaagd te zijn door allerlei TnpB’s ‘door te lichten’ en daaruit de effectiefste twee heeft te kiezen: ISAam1 en ISYmu1
CRISPR-Cas-systemen, bestaande uit eiwit- en RNA-componenten, zijn natuurlijke afweermechanismes van bacteriën tegen binnendringende virussen. Sinds 2012 wordt die methode vooral enthousiast gebruikt door onderzoekers, maar steeds vaker ook in de klinische praktijk, om genetische ‘ontsporingen’ in het genoom te repareren, maar ook om genomen van organismen aan te passen om die iets te laten doen wat ze in de natuur niet doen (bijvoorbeeld bepaalde al dan niet natuurlijke ‘biomoleculen’ te maken).
Een belangrijk component van de CRISPR-methode is de genschaar. Cas9 en Cas12 zijn twee voorbeelden van zo’n genoomstrengdoorknipper. Een probleem is de grootte van de genscharen, waardoor het een probleem wordt die in cellen af te zetten om het ‘herstelwerk te doen, maar ook om alle plekken op het genoom te bereiken
Al langer wordt er gezocht en niet zo lang geleden nam ik (=as) uit India een bericht over TnpB mee. TnpB’s zijn nucleases (eiwitten die RNA’s en DNA’s afbreken) die hun oorsprong vinden in transposons (springende genen) en begeleid worden door gidsRNA. Ze zouden in feite evolutionair de ‘voorouders’ zijn van nucleases als Cas9 en Cas12. Alleen bestaat zo’n TnpB-nuclease uit ‘maar’ zo’n 300 tot 500 aminozuren, ongeveer eenderde van Cas12 of Cas9: honkballen in plaats van voetballen. Die kleinere genscharen zijn niet alleen handig om ze de cel binnen te brengen, maar kunnen ook het DNA om meer plaatsen bewerken dan de veel grotere Cas-eiwitten.
Inefficiënt
Aan de voordelen hangt een ‘prijskaartje’: TnpB is vrij inefficiënt. Nu hebben onderzoekers rond Gerald Schwank van de universiteit van Zurich (met behulp van ki, dus) zitten ‘frutten’ aan die nuclease. “Door het kleine maar krachtige eiwit TnpB te bewerken, hebben we een variant kunnen ontwikkelen waarmee DNA 4,4 keer efficiënter kan worden veranderd en daarom effectiever is als hulpmiddel voor het bewerken van genen”, zegt Schwank.
TnpB-eiwitten worden aangetroffen in verschillende soorten bacteriën en archaebacteriën. Het door de onderzoekers onderzochte TnpB is afkomstig van de bacterie Deinococcus radiodurans, die onder meer goed bestand is tegen radioacitiviteit (vandaar de naam), maar ook weinig last lijkt te hebben van kou en droogte.
Het compacte TnpB-eiwit bleek goed in staat het genoom van menselijke cellen te bewerken, maar deed dat lang niet in alle cellen. De onderzoekers sleutelden daarom aan TnpB om het bewerken van DNA van zoogdiercellen efficiënter te maken. Zo kwamen ze bij muisjes tot zeer aanvaarbare bewerkingsafficiënties tot 75%.
Om erachter te komen welke kenmerken in de DNA-doelsequenties de efficiëntie van genoombewerking bepalen, testten de onderzoekers het geoptimaliseerde TnpB-eiwit op meer dan tienduizend verschillende doelwitsequenties. Ze ontwikkelden een nieuw ki-model dat de efficiëntie van TnpB-bewerking op elke doellocatie kan voorspellen.
“Dat model kan voorspellen hoe goed TnpB in verschillende scenario’s zal werken, waardoor het eenvoudiger en sneller wordt om succesvolle experimenten voor genbewerking te plannen”, zegt medeonderzoekster Kim Marquart.
“Voor de dierproeven konden we klinisch geteste adeno-geassocieerde virussen gebruiken om het CRISPR-gereedschap efficiënt naar muiscellen te transporteren. Door zijn kleine omvang kan het TnpB-genbewerkingssysteem in één enkel virusdeeltje worden verpakt”, zegt ze. Met CRISPR-Cas9-componenten moet het ‘gereedschap’ in verschillende virusdeeltjes worden verpakt, waardoor grotere doses moeten worden toegediend.
Hoog cholesterol
In het huidige project onderzochten de onderzoekers of de TnpB kan worden gebruikt om patiënten met familiale hypercholesterolemie te behandelen. Deze erfelijke ziekte leidt gedurende het hele leven tot ernstig verhoogde cholesterolwaarden. De ziekte verhoogt het risico op vroegtijdig optredende hart- en vaatziekten. Schwank: “We zijn erin geslaagd een gen te veranderen dat het cholesterolgehalte reguleert en zo het cholesterolgehalte bij de behandelde muizen met bijna 80% te verlagen. Het doel is om vergelijkbare genbewerkingsstrategieën te ontwikkelen voor mensen.”
Bron: Alpha Galileo