In de ‘gewone’ CRISPR/Cas9-techniek (boven) zorgt het gids-RNA (groen) dat het knip-en-plakwerk op de juiste plaats gebeurt. De Zuid-Koreanen hebben de ingrediënten ietwat aangepast voor de basevervanger: Cas9 werd nCas9 (nickase) en daaraan werd het enzym cytosinedeaminase geplakt. Daarmee werd de C vervangen door U (uracil) dat normaal niet in DNA voorkomt (maar wel in RNA), maar bij replicatie wordt vervangen door T (thymine)
Een DNA-streng van een mens is zo’n driemiljard nucleotiden (DNA-letters) lang. Toch schijnt de modernste versie van de vrij nieuwe CRISPR/Cas9-methode in staat om heel precies een zo’n DNA-bouwsteen te vervangen door een ander, constateerden onderzoekers rond Jin-soo Kim van de nationale universiteit in Seoel (Zuid-Korea). Kim: “Dit is voor het eerst dat de effectiviteit van deze basevervanger (een base is nucleotide; as) over het hele genoom is beoordeeld. ”
De snelle ontwikkeling van de knip-en-plak-techniek CRISPR/Cas9 heeft heel wat biologen en niet-biologen razend enthousiast gemaakt. Er waren al technieken om het genoom mee te bewerken zoals de zinkvingertechniek, maar die legden het af tegen de nauwkeurigheid en goedkoopte van de van bacteriën geleende CRISPR-methode. CRISPR/Cas9 en CRISPR/Cpf1 worden nu over de hele wereld gebruikt om stukjes DNA te vervangen of te verwijderen.
Vorig jaar werd een CRISPR-techniek voorgesteld die niet alleen geen onvoorziene veranderingen door het knip-en-plakwerk verzoorzaakte, maar ook slechts een van de vier nucleotiden van DNA kan vervangen (A, T, C of G). Het schijnt dat die puntsmutaties, zoals die genoemd worden, de oorzaak zijn van ernstige ziektes als taaislijmziekte, sikkelcelanemie of, minder ernstig, kleurenblindheid.
Bij die aangepaste CRISPR-methode wordt een extra knip-en-plakenzym gebruikt: cytosinedeaminase. Dat vormt een complex met nCas9 (nickase). Dat deaminase is gespecialiseerd in het vervangen van de cytosinenucleotide (C) door uracilnucleotiden (U). Normaal zit de nucleotide uracil (U) niet in DNA maar in RNA, maar bij de replicatie wordt uracil vervangen door thymine (T).
De vraag die de onderzoekers zich stelden, was of deze verfijnde genschaar alleen actief is bij genen met verkeerde nucleotiden of dat ze hun knip-en-plakwerk ook buiten het ‘operationele gebied’ op het DNA uitvoerden.
Nauwkeurig
Een maand nadat de onderzoekers in Zuid-Korea hadden aangetoond bij dieren dat ‘basevervanging’ (het vervangen, dus, van een van de vier nucleotiden door zijn tegenhanger) prima werkt in het dystrofine– en het tyrosinase-gen, hebben ze nu ook aannemelijk gemaakt dat het herstellen van puntmutaties met de basevervanger over het hele genoom vrij nauwkeurig is.
Om dat te controleren veranderden de onderzoekers de controletechniek Digenome-seq zo dat die bruikbaar werd voor de basebewerkingsmethode. Digenome-seq werd vorig jaar gebruikt (en gewogen) om de nauwkeurigheid van CRISPR/Cpf1 en -/Cas9 te controleren. De onderzoekers hebben ook aan het programma Digenome 2.0 gesleuteld om de missers beter in beeld te krijgen en om het gids-RNA (een RNA-molecuul om de ‘machine’ naar de juiste plaats op het genoom te leiden) er uit te pikken dat het beste functioneert zonder onbedoelde veranderingen (of althans zo min mogelijk).
Met die aangepaste techniek toonden ze de nauwkeurigheid van de gebruikte methode aan, nauwkeuriger zelfs dan wat zij de derdegeneratie CRISPR/Cas9-methode noemen. Ze beproefden zeven verschillende gids-RNA’s en vonden dat de gecombineerde cytosinedeaminase/nCas9-combinatie zeer specifiek te werk gaat. “Waarschijnlijk zullen deze basevervangers net zo populair worden als de CRISPR-technologie”, stelt Kim. Maar zijn die basevervangers dan zelf een vorm van de CRISPR-technologie, vraag ik me bij zo’n opmerking af.
Bron: EurekAlert