De DNA-kurkentrekker die RNA-polmyrase op de voet volgt bij het afschrijven van DNA op RNA (afb: Pallav Kosuri et al./Cell Reports Methods)

Wetenschappers onder aanvoering van Pallav Kosuri van het Salkinstituut gebruikten de DNA-origami-techniek om de kleurstofcyclus-ORBIT te bouwen, een methode om eiwit-DNA-interacties urenlang stap voor stap (dat wil zeggen base voor base) te volgen. Terwijl de kurkentrekkersteel zich hecht aan een eiwit, versterken het X-vormige handvat en de fluorescerende kleurstofsonde de beweging van de onderliggende eiwit-DNA-interactie.
“Als je niet weet hoe iets beweegt, weet je niet wat het doet,” zegt Kosuri, “en als je de functie van moleculen wilt begrijpen, manipuleren en veranderen, is het begrijpen van hun fysieke bewegingen net zo belangrijk als het begrijpen van hun chemische reacties. Het verschil is dat we een uitgebreide catalogus hebben van de chemische reacties, terwijl de mechanische kant nog steeds een soort Wilde Westen (=een onbekende; as) is.”
De onderzoekers begonnen met DNA-origami (origami is in feite Japanse papiervouwkunst), een methode die DNA-bouwstenen (nucleotiden ook wel DNA-letters genoemd) gebruikt om op maat gemaakte, zelfassemblerende nanostructuren te maken met een breed scala aan toepassingen; van medicijnafgifte, lab-op-chip-systemen tot (nu ook) fundamenteel biologisch onderzoek. Vervolgens ontwikkelden ze ORBIT, een methode die DNA-origami gebruikt om fluorescerende nanostructuren te bouwen voor het visualiseren van moleculaire bewegingen.

Technische beperkingen hebben het lange tijd moeilijk zo niet onmogelijk gemaakt om molecuulbewegingen over langere perioden te meten. Fluorescentiemicroscopie is een krachtige technologie, maar de observatietijd wordt beperkt door de tijd dat fluorescerende merken helder blijven (na verloop van tijd doven ze altijd uit). Hun meest recente werk overwint dit probleem met een ‘kleurstofcyclus’-strategie voor ORBIT die fluorescerende merken constant aanvult, waardoor het meetvenster wordt verlengd van seconden tot uren.
Hierdoor konden de onderzoekers de draaiing van een enkel RNA-polymerasemolecuul meten terwijl het DNA wordt afgelezen met een ‘resolutie’ op baseniveau en over tot nu ongekend lange perioden. De nieuwe methode zou belangrijke mechanische inzichten kunnen verschaffen in hoe genen in cellen worden afgeschreven.

Bouwen met DNA

Het unieke vermogen van DNA-strengen om zich met elkaar te verbinden, bracht wetenschappers decennia geleden al op het idee om architectonische elementen van DNA ten gebruiken om andere structuren dan de dubbele helix te bouwen? Kosuri: “DNA-origami-structuren bouwen zichzelf op. Hun structuur is gecodeerd in hun samenstelling. Dit is essentieel voor ons vermogen om bijna atomaire precisie in onze ontwerpen te bereiken.”

Bij een benadering van bovenaf ben je beperkt tot tientallen nanometers als beste mogelijke resolutie, maar aangezien DNA-origami zelfassemblerend is, kunnen de structuren in plaats daarvan van onderaf worden opgebouwd, waardoor een veel kleinere resolutie mogelijk is met behoud van precisie en aanpassingsmogelijkheden. “Je kunt 3D-structuren ontwerpen met een hogere precisie en resolutie dan commerciële productiemethoden, en zonder machine. Je voegt de componenten samen en laat ze combineren om iets op nanometerschaal te maken, of zelfs kleiner,” zegt Kosuri. “Het is snel te herhalen, het is goedkoop, het is biologisch afbreekbaar en het is echt leuk om mee te werken.”
Het lab van Kosuri is een pionier geworden in DNA-origami-onderzoek, zozeer zelfs dat hij door ingenieur en docent Mark Rober werd gevraagd om ’s werelds kleinste Nerfpistool volledig van DNA te bouwen. Hoewel het Kosurilab de kans om de ontwerpmogelijkheden van DNA te demonstreren zeer waardeerde, richten ze zich nu op het onthullen van moleculaire beweging met behulp van dezelfde technieken.

Eiwitten die met DNA wisselwerken, zoals RNA-polymerase, moeten draaien om de helixstructuur van DNA te kunnen volgen. RNA-polymerase kopieert genetische informatie van DNA naar RNA. Dat boodscahpper-RNA levert weer instructies die de cel gebruikt om eiwitten te bouwen in het ribosoom.
De transcriptie van DNA door RNA-polymerase is essentieel voor de ontwikkeling en de dagelijkse activiteit van elke cel. Waarom bestuderen we dan niet de beweging van deze cruciale moleculaire machine? Kosuri: “We kunnen de beweging gewoonweg niet zien. De diameter van de cirkelvormige rotatie van DNA is 100 keer kleiner dan de golflengte van zichtbaar licht, maar in plaats van dat te meten, dachten we dat we een zichtbare DNA-origami-rotor konden maken die aan de DNA-streng konden bevestigen en vervolgens de beweging van de rotor konden meten.”

ORBIT

ORBIT doet precies wat de naam al zegt (orbit is Engels voor baan). Het is een methode die gebruikmaakt van met fluorescentie gemerkte DNA-origami-rotoren om de draaiing van DNA te volgen terwijl het draait tijdens de interactie met RNA-polymerase. Dankzij de precieze, op maat gemaakte vorm van DNA-origami behoudt de methode een resolutie van één basepaar, waardoor wetenschappers de rotatie kunnen meten terwijl RNA-polymerase elk basepaar doorloopt, van A-T naar C-G enzovoort.
“Het is zo simpel als het bevestigen van een groter object aan een kleiner object,” zegt Kosuri. “Als het kleinere het object draait, kunnen we de draaiing van het grotere object zien en dat vastleggen met een standaardmicroscoop.”

De DNA-origami-rotor die aan de DNA-streng is bevestigd, lijkt op een kurkentrekker (ik=as zou zeggen helicopter): een lange, spiraalvormige steel met een groot X-vormig handvat met een fluorescerend merk. Zodra de spiraalvormige steel aan RNA-polymerase is bevestigd, versterkt het grote, fluorescerende X-vormige handvat de beweging van het onderliggende spiraalvormige DNA, waardoor wetenschappers de rotatie kunnen zien en meten.

“ORBIT had de potentie om een ​​krachtige methode te zijn voor het bestuderen van RNA-polymerase en andere eiwitten die met DNA interageren,” zegt eerste auteur Amanda Wacker, “Net als bij andere fluorescentievolgmethoden worden de observatietijden van ORBIT beperkt door fotobleking van de fluorescerende merken op de DNA-origami-rotor. Dat is wat de inspiratie vormde voor kleurstof-ORBIT.”
In plaats van een enkel fluorescerend merk aan de DNA-origami-rotor te bevestigen, vult de kleurstofstrategie de fluorescerende merken continu aan tijdens de observatie.
“Door die kleurstofverandering te combineren met ORBIT konden we de beperkingen van fotobleaching overwinnen en de transcriptie van RNA-polymerase over lange tijdschalen volgen met behoud van onze resolutie van één basenpaar,” zegt Wacker. “We konden kluerstof-ORBIT vervolgens gebruiken om DNA-rotaties tijdens transcriptie gedurende 10 minuten te volgen.”

Kosuri: “De enige reden dat de mechanische kant een mysterie bleef, is omdat we die niet kunnen zien. Deze methode maakt het mogelijk om bewegingen op een fundamenteel, moleculair niveau te zien en ik denk dat de methode in bredere zin gebruikt kan worden om het grote, nog onontdekte universum van structurele bewegingen in de biologie te begrijpen.”

Bron: phys.org